Плацебо-контролируемое двойное слепое рандомизированное исследование применения L-карнитина, ацетил-L-карнитина или комбинации L-карнитина и ацетил-L-карнитина у мужчин с идиопатической астенозооспермией
L-карнитин (LК) играет центральную роль в энергетическом метаболизме клеток, выступая в роли транспортера активированных длинноцепочечных жирных кислот (ацил-КоА) в митохондрии, где происходит их бета-окисление [1–3]. Важная роль в клеточном мета- болизме сперматозоидов убедительно подтверждается высоким уровнем LК в аспирате придатков благодаря активному механизму секреции [4], а также тем, что подвижность сперматозоидов связана с повышением уровня LК в просвете придатков и ацетил-L-карнитина (АLК) в сперматозоидах [5–7].
Избыток свободных радикалов кислорода (СРК) и других окислительных радикалов связаны с мужским бесплодием [8–15]. Определение общей способности к связыванию свободных радикалов (ОССР) – это не- давно разработанный анализ, позволяющий определить общую способность биологических жидкостей или клеточных антиоксидантов к нейтрализации токсичности различных радикалов [16, 17]. Анализ ОССР помогает различить разные формы СРК и определить роль специфических антиоксидантов и пути их формирования при развитии токсикологического или патологического процесса.
Раннее применение анализа ОССР в андрологии позволило обнаружить снижение антиоксидантной эффективности семенной плазмы у мужчин с бесплодием и статистически значимую корреляцию между связывающей способностью к гидроксильным радикалам и подвижностью сперматозоидов [18]. Кроме того, показано, что лечение пациентов с астенозооспермией антиоксидантами приводит к улучшению качества эякулята [19, 20] и частоты наступления беременности [20].
LK применялся для лечения отдельных форм олигоастенозооспермии [21–25], учитывая его роль в энергетическом метаболизме. Хотя предполагалась вторичная роль LК как антиоксиданта [26], еще только предстоит определить механизмы, ответственные за антиоксидан- тную защиту от окислительного повреждения СРК.
Мы приводим результаты 6-месячного двойного слепого рандомизированного плацебо-контролируемого исследования применения LК или АLК или их комбинации у мужчин с бесплодием и астенозооспермией. Основным оцениваемым показателем была эффективность этих препаратов в улучшении подвижности сперматозоидов и изменении общей способности семенной плазмы к связыванию свободных радикалов после лечения.
Материалы и методы
Отбор больных
В исследование включено 60 пациентов (возраст 24–38 лет, средний возраст – 30 лет) с идиопатической астенозооспермией. Больных отбирали в отделе- нии андрологии, отделе эндокринологии, госпиталя Умберто I, политехнического университета Марке, Анкона, Италия. У всех мужчин диагностировано бесплодие в течение более 2 лет, и они проходили скрининг, включавший сбор анамнеза и клинический осмотр. Каждому пациенту оценивали объем яичек с помощью орхидометра Прадера. Для подтверждения клинического диагноза проводили следующие исследования: анализ эякулята, Mar-тест (SpermMar test, CGA, Флоренция, Италия) на антиспермальные антитела; посев эякулята и мазок из уретры для выявления Chlamydia и Mycoplasma urealyticum; определение уровня фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, тестостерона, эстрадиола и пролактина с помощью коммерчески доступных радиоиммунных методов; ультразвуковое исследование (УЗИ) органов мошонки, простаты и семенных пузырьков, а также УЗИ с доплером сосудов лозовидного сплетения для выявления анатомических изменений и варикоцеле.
Ни в одном из случаев не было выявлено женского фактора бесплодия. У всех партнеров (возраст 21–32 года, средний возраст – 26 лет) были регулярные овуляции, подтвержденные двухфазовым изменением базальной температуры и уровнем прогестерона в лютеиновую фазу. В каждом случае при УЗИ органов малого таза не было выявлено анатомических изменений, а при гистеросальпингографии не показано нарушений проходимости маточных труб.
Дизайн исследования и лечения
Включенные больные получали терапию по двойной слепой схеме: LК (флаконы по 10 мл, содержащие 3 г/сут карнитина) (Sigma Tau, Pomezia, Italy), n = 15); или АLК (таблетки 3 г/сут, Zibren (Sigma Tau), n = 15); или комбинацию LК (флаконы по 10 мл, содержащие 2 г/сут карнитина) и АLК (таблетки, содержащие 1 г/сут Zibren) (n = 15); или идентичное по виду плацебо (каждый флакон по 10 мл с плацебо содержал яблочную кислоту, натрия бензоат, натрия сахарината дигидрат, безводный цитрат натрия, ананасовый ароматизатор и негазированную воду). Каждая таблетка плацебо содержала 1-гидролактозу, стеарат магния, поливинилпирролидон, кукурузную муку и оболочку из ацетофталата целлюлозы, диметикона, этилфталата (Sigma Tau). Все пациенты принимали один флакон и 2 таб- летки 3 раза в сутки. Выбранную дозу карнитина наиболее часто применяют для лечения других заболеваний (заболевания нервной системы, сердца, мышц), и она совпадает с используемой в других исследованиях дозой по мужскому бесплодию [21–25].
Дизайн исследования включал 1 мес вводной фазы, 6 мес приема препаратов (n = 45) или плацебо (n = 15) и 3 мес последующей оценки (контроль при визитах Т-1, Т0, T3, T6, T9). Для оценки стабильности параметров эякулята каждый пациент сдавал 2 анализа эякулята с разницей в 1 мес (Т-1 и Т0) до начала лечения согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [27].
Анализ проводился в различные временные точки. Исследование эякулята выполняли при визитах Т-1, Т0, Т3, Т6 и Т9, включая компьютерный анализ (CASA) при визитах T0, Т3, Т6, Т9 для оценки изменений параметров спермограммы [27]. Для оценки каких-либо различий на фоне терапии, при визите T0 и T6 проводили анализ ОССР семенной плазмы к раз- личным СРК [16, 17]. Все анализы проводили в лечебных группах и группе плацебо. Также анализировались приверженность схеме лечения и возможные побочные эффекты. При визитах Т0 и Т6 выполняли анализ крови для оценки безопасности лечения.
На основании ранее полученных результатов в нашей группе и данных других исследователей [20–25] основным критерием эффективности было выбрано улучшение подвижности сперматозоидов (общей и прогрессивной).
Данное исследование было одобрено Министерством здравоохранения Италии и этическим комитетом медицинского факультета в госпитале Университета Анконы. Все пациенты подписали информированное согласие.
Критерии включения
В исследовании были следующие критерии включения: 1) возраст 20–40 лет, бесплодие в течение более 2 лет регулярной половой жизни с фертильной партнершей; 2) нормальные реологические параметры эякулята (внешний вид, консистенция и разжижение), объем и pH в пределах нормы; 3) количество сперматозоидов > 20 × 106 /мл, подвижность сперматозоидов (прогрессивная подвижность, класс a и b согласно критериям ВОЗ [27] < 50 % и количество сперматозоидов с нормальной морфологией > 30 %; 4) количество лейкоцитов < 1 × 106 /мл, отрицательный результат посева эякулята и мазка из уретры на Chlamydia и Mycoplasma urealyticum; 5) нормальный уровень гонадотропинов, тестостерона, эстрадиола и пролактина; 6) отсутствие половых инфекционных заболеваний, анатомических изменений половой системы, включая варикоцеле и антиспермальные антитела; 7) отсутствие системных заболеваний или приема других препаратов в течение 3 мес до включения в настоящее исследование; 8) пациенты не должны были курить, принимать алкоголь или запрещенные препараты или подвергаться воздействию вредных веществ.
Пациентам необходимо было соблюдать стандартную диету, чтобы избежать различий в приеме карнитина с едой. Ни один из пациентов не страдал от недостаточности карнитина.
Для включения в исследование пациентам необходимо было соответствовать выше приведенным критериям включения при визите T-1 и T0. Исключались больные со временным снижением качества эякулята во время периода вымывания и пациенты с внезапным (независимым от лечения) улучшением показателей эякулята.
Анализ эякулята
Качество эякулята оценивалось одним биологом по следующим показателям: концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов в соответствии с критериями ВОЗ [27].
Для оценки подвижности сперматозоидов использовали компьютерный анализ эякулята (CASA) по стандартной методике [20]. Один образец (3 мл) погружали в камеру 20 нм. Загружали 2 камеры 20 нм
Определение общей способности к связыванию свободных радикалов
Образец эякулята (1 мл) центрифугировали после разжижения в течение 15 мин с частотой 2000 об/мин, с разделением супернатанта плазмы и обогащенной фракции сперматозоидов, которые хранили до анализа при температуре –80 °C. Небольшое количество семенной плазмы оценивали до хранения для исключения наличия сперматозоидов в супернатанте.
Анализ ОССР основан на реакции между различными формами СРК и субстратом Α-кето-Υ-метилбутановой кислоты (КМБК), которая окисляется до этилена. Антиоксидантная эффективность образца рассчитывалась по способности связывать выделяющиеся СРК, препятствуя взаимодействию с КМБК и образованию этилена [15]. Техническая процедура анализа ОССР выполнялась согласно ранее опубликованным данным из нашей лаборатории [18]. Для различных систем, создающих свободные радикалы, показатели ОССР рассчитывали по уравнению: ОССР = 100 – (SA/CA × 100), где SA и CA – интегрированные области, рассчитанные под наименьшей площадью кинетической кривой, построенной во время взаимодействия образца (SA) и контрольной реакции (CA) соответственно.
Статистический анализ
Во всех лечебных группах применялась описательная статистика по каждому изучаемому показателю.
Гомогенность 4 групп больных до начала лечения (визиты T-1 и T0) оценивали с помощью анализа вариант с лечением как промежуточным фактором (4 уровня: плацебо, LК, АLК, комбинация LК и АLК).
Для всех непрерывных показателей, определяемых при визитах Т-1, Т0, Т6 и Т9, рассчитывались процентные изменения по отношению к визиту Т-1 (или Т0, если большинство показателей при визите Т-1 не были получены) для исключения влияния возможных различий в начале исследования.
Для разделения влияния 2 молекул LК и АLК, а также для оценки их комбинированного применения рассчитывалось 2 новых «лечебных» показателя: первый, LКTX отражал терапию LК в виде моно или комбинированной терапии; АLКTX отражал прием АLК в виде моно или комбинированной терапии. Для оценки значимости времени и влияния терапии на процентные изменения проводился анализ изменений при повторных визитах.
Для непрерывных показателей, определяемых исходно и в конце лечения, рассчитывались абсолютные изменения, также проводился анализ вариант с лечением как промежуточным фактором.
Для дискретных показателей при каждом визите выполнялся тест хи-квадрат для оценки корреляции с лечением (с учетом 1 фактора на 4 уровнях).
Для основного параметра эффективности, подвижности сперматозоидов, как общей, так и прогрессивной, проводились дальнейшие анализы. Для 2 показателей рассчитывались изменения между визитами Т0 и Т6, и улучшение больше или равное медиане считалось ответом на лечение. При этом рассчитывали 2 новых показателя, принимая пациентов с ответом на лечение и без него в отношении общей и прогрессивной подвижности как 1 и 0 соответственно.
Для оценки того, влияют ли исходные и компьютеризированные показатели на более выраженные изменения подвижности, рассчитывались 2 логистические модели, с учетом соответственно 2 показателей ответа, как зависимых, а исходной общей подвижности, трековой скорости, прямой скорости, ОССР и концентрации сперматозоидов как независимых переменных.
Результаты
Один пациент вышел из исследования. После открытия листа рандомизации в конце исследования показано, что исследование завершили 44 из 45 больных в лечебных группах (подгруппа А: LК, 15 пациентов, подгруппа В: АLК, 15 пациентов, подгруппа С: комбинированная терапия, 14 пациентов) и 15 пациентов в группе плацебо.
В табл. 1 представлены средние показатели эякулята со стандартным отклонением при каждом визите; процентные отклонения по сравнению с исходным уровнем приведены в табл. 2. Процентные отклонения прогрессивной подвижности сперматозоидов во всех группах при каждом визите показаны на рис. 1.
Однофакторный анализ вариант, проведенный по показателям для определения гомогенности (процентные отклонения по сравнению с Т-1 или Т0) при исходном визите (Т0 или Т3), показал отсутствие статистически значимых различий между группами в отношении подвижности (общей и прогрессивной), концентрации сперматозоидов, пропорции атипичных сперматозоидов, объема эякулята или трековой скорости. Напротив, процентные отклонения прямой скорости между визитом T0 и T3 были статистически значимо выше в подгруппе C (LК и ALК) по сравнению с группой плацебо (44,86 и 76,24 vs –4,59 и 37,05; F = 3,077; p = 0,035). Примечание: показатели выражены в процентных отклонениях от визита Т0. Другими словами, у пациентов в группе комбинированной терапии в течение первых 3 мес терапии наблюдалось статистически значимое улучшение.
Также показано статистически значимое улучшение общей подвижности сперматозоидов у больных, получавших ALК, как в виде моно-, так и комбинированной терапии с LК (с 3,3 ± 17,4 при T0 до 37,7 ± 27,8 при T6; F = 11,19; p = 0,001) (рис. 2).
Анализ прогрессивной подвижности сперматозоидов показал схожие результаты (с –2,9 ± 26 при T0 до 63 ± 66,8 при T6; F = 12,68; p = 0,001) (рис. 3). Примечание: показатели выражены в процентных отклонениях от визита Т-1.
У пациентов, получавших комбинированную терапию, отмечалось улучшение прогрессивной подвижности по сравнению с группами монотерапии, хотя различия в параметрах подвижности не были статистически значимыми (см. рис. 1). В группе плацебо не выявлено статистически значимых изменений.
Во всех группах больных, получавших карнитин, обнаружена статистически значимая корреляция изменений общей и прогрессивной подвижности и исходных показателей. У пациентов с более низкими исходными показателями подвижности вероятность ответа на лечение была статистически значимо выше.
После вымывания (T9) характеристики подвижности сперматозоидов (общая и прогрессивная подвижность, прямая скорость) в лечебных группах были статистически значимо ниже по сравнению с визитом Т6.
В группе пациентов, получавших АLК (в виде моноили комбинированной терапии), на фоне терапии наблюдались статистически значимые изменения концентрации (с 6,95 ± 22,06 при визите T0 до 42,88 ± 50,80 при визите T6; F = 3,611; p = 0,015). Примечание: показатели выражены в процентных отклонениях от визита Т-1.
Между визитом Т6 и Т0 показано статистически значимое снижение числа клеток с атипичной морфо логией. При этом улучшение было статистически значимым в группе пациентов, получавших LК.
У пациентов не отмечалось статистически значимых различий в объеме эякулята и трековой скорости.
Общая способность к связыванию свободных радикалов
В табл. 3 приведены средние показатели ОССР и стандартное отклонение при каждом визите, а также процентное отклонение по сравнению с исходным уровнем. Анализ ОССР семенной жидкости для различных СРК показал статистически значимое снижение уровня гидроксильных и пероксильных радикалов в лечебных группах, но отсутствие статистически значимых изменений в группе плацебо.
Увеличение показателей ОССР между визитом Т0 и Т6 положительно коррелировало с улучшением общей и прогрессивной подвижности для обоих радика лов, и с трековой или прямой скоростью для гидроксильных и пероксильных радикалов соответственно (табл. 4). Кроме того, обнаружено, что различия в прогрессивной подвижности зависят от исходных показателей ОССР (для гидроксильных радикалов).
Спонтанные беременности
В течение периода наблюдения наступило 12 спонтанных беременностей. Открытие протокола рандомизации показало, что 9 беременностей относились к группе пациентов, получавших карнитин. Пять из них наступили у партнеров больных, получавших комбинированную терапию (3 случая через 3 мес и 2 – через 5 мес лечения). Две беременности наблюдалось в группе LК (после 3 мес терапии). Еще 2 беременности отмечены в группе больных, получавших АLК (1 через 2 мес, другая – через 5 мес терапии). Три из 12 беременностей наступили у партнеров пациентов в группе плацебо (через 1 и 3 мес лечения и после 2 мес вымывания).
Обсуждение
В нескольких контролируемых и неконтролируемых исследованиях получены данные о положительном влиянии терапии LК и его ациловых производных при некоторых формах олигоастенозооспермии [21–25]. В частности, в совсем недавно проведенном контролируемом исследовании показана эффективность комбинированной терапии LК и АLК в улучшении подвижности сперматозоидов, особенно у больных с более низкими исходными показателями [25]. Основным объяснением служит центральная роль карнитина в энергетическом метаболизме и его накопление в жидкости придатков и сперматозоидах как в свободной, так и в ацетилированной форме [4]. Хотя некоторые данные отражают вторичную роль карнитина как антиоксиданта [26], его эффективная роль и механизм действия по-прежнему остаются открытым вопросом.
В литературе представлено много данных о неблагоприятном влиянии СРК и других прооксидантов на качество эякулята [8–15]. С другой стороны, некоторые данные говорят о снижении способности семенной плазмы к связыванию свободных радикалов у мужчин с бесплодием и патоспермией [18, 28, 29].
Примечательно, что показано улучшение качества эякулята у мужчин с бесплодием на фоне прием антиоксидантов, таких как глутатион и коэнзим Q.
В нашем двойном слепом рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании оценивали следующие показатели: 1) эффективность различных препаратов в улучшении параметров эякулята и сравнение монотерапии LК и АLК или комбинации LК+АLК; 2) различный ответ в зависимости от исходных параметров эякулята; 3) различия в ОССР и ее корреляция с параметрами эякулята после лечения.
Что касается первого показателя, основной целью исследования было улучшение общей и прогрессивной подвижности сперматозоидов (включая прямую скорость, определяемую анализом CASA) у пациентов, принимавших АLК в виде монотерапии или в комбинации с LК. Интересно отметить, что комбиниро ванная терапия LК и АLК более выражено улучшила прогрессивную подвижность и прямую скорость сперматозоидов по сравнению с монотерапией каждым из препаратов в отдельности. Хотя это улучшение было статистически значимым только для прямой скорости при визите T3, мы считаем необходимым это отметить с биологической точки зрения, поскольку первый показатель важен для мужской фертильности [27].
Период вымывания и 2 анализа эякулята до начала лечения позволили минимизировать влияние спонтанных различий в показателях спермограммы и оценить лечебный эффект [27]. Статистически значимое снижение подвижности сперматозоидов через 3 мес вымывания (с визита T6 до визита T9) показывает связь между улучшением показателей эякулята и приемом карнитина. Кажется обоснованным связать это с отсутствием положительного влияния карнитина на энергетический метаболизм сперматозоидов и ОССР после прекращения терапии.
Примечательно, что эффективность лечения отличалась в зависимости от исходных данных подвижности, при этом более низкие показатели коррелировали с хорошим ответом на лечение. Полученные данные полностью соответствуют недавно опубликованным результатам 2 других исследований [24, 25].
Улучшение способности семенной плазмы к связыванию свободных гидроксильных и пероксильных радикалов у пациентов, получавших лечение, по анализу ОССР – это один из наиболее важных результатов нашего исследования. Показана положительная корреляция ОССР и улучшение подвижности сперматозоидов; также выявлена статистически значимая зависимость изменения прогрессивной подвижности и исходных показателей ОССР.
Кроме того, более низкие показатели ОССР (гидроксильных радикалов) коррелировали с более выраженным ответом на прием карнитина. Эти данные убедительно поддерживают роль карнитина как антиоксиданта и патогенетическое участие сниженной ОССР при астенозооспермии согласно ранее опубликованным результатам [18].
В настоящее время остается нерешенным вопрос, как именно карнитин действует в роли антиоксиданта. С биохимической точки зрения он напрямую не связывает СРК.
Мы можем только предполагать наличие непрямого механизма, возможно связанного со снижением перекисного окисления липидов [30–32], и протективного влияния на клеточные мембраны и окисление белков, а также окислительное повреждение пирувата и лактата [33].
У пациентов, получавших LК, также показано статистически значимое уменьшение числа сперматозоидов с нарушенной морфологией. Эти данные можно попробовать объяснить возможной метаболической модификацией на фоне приема карнитина и прямым влиянием на клеточные гаметы, а также улучшением способности семенной плазмы связывать свободные радикалы.
Хотя наступление беременности не было оцениваемым показателем в нашем контролируемом исследовании, что связано со многими другими факторами, интересно отметить, что у партнеров пациентов, получавших карнитин, наступило 9 беременностей, 5 из которых наблюдались в группе комбинированной терапии.
В отношении беременности партнеров у пациентов в группе плацебо можно сказать, что 2 из них наступили через 1 мес лечения и 2 мес вымывания соответственно, поэтому ни одна из них по времени не была связана с терапией.
Совместно полученные данные позволяют предположить, что длительный прием карнитина эффективен для улучшения показателей эякулята и способности к зачатию. Следуя оцениваемым критериям исследования, мы можем сделать первый вывод, что прием LК и АLК позволяет улучшить подвижность сперматозоидов у пациентов с идиопатической астенозооспермией, в особенности у больных с более низкими исходными показателями и низкой способностью связывать свободные радикалы. Комбинированная терапия LК и АLК улучшает прогрессивную подвижность (хотя статистически незначимо) и прямую скорость (статистически значимое улучшение) по сравнению с монотерапией отдельно каждым из препаратов. Второй вывод заключается в том, что LК и АLК позволяют улучшить общую способность семенной плазмы связывать свободные радикалы в этой же группе больных.
